近日，法国赛诺菲生物工艺分析部门科学家 Suzana Petrovic，Yann Fromentin，Hervé Dubois 等在 BioProcess International 期刊上发表了题为「Host-Cell Protein Analysis to Support Downstream Process Development」的文章^[1]，介绍了该部门将 Gyrolab 免疫分析工作站与自动液体处理系统相结合，建立了全自动化的高通量宿主蛋白分析平台的应用。本文节选自该文章（点击链接查看原文：https://page.gyrosproteintechnologies.com/case-study-host-cell-protein-analysis-to-support-downstream-process-development）。

宿主细胞蛋白 (Host Cell Protein, HCP) 是生物制品生产过程中产生的关键工艺相关杂质之一，虽然含量很低，但可能会导致患者出现不良免疫反应或导致产品蛋白的降解等，例如在 Lebrikizumab 的临床试验中曾报道了患者对 Phospholipase B-like 2（PLBL2）杂质蛋白的免疫反应，从而不得不在后期改变工艺^[2]；MCP- 1 HCP 也曾在几个项目中被检测到 ^[3]，由于严重的不良反应，导致一项临床试验暂停。另外，有研究发现 Cathepsin D 和 L 可以诱发终产品蛋白的降解^[4,5]。因此，在下游工艺（DSP）开发中，需要通过实验设计（DoE）优化每个纯化工艺步骤以尽可能清除 HCP 残留，并建立合适的 HCP 检测方法来监控生物制品的质量。

ELISA 是 HCP 检测的黄金标准方法，但是基于微孔板的传统 ELISA 具有以下局限：① 多个孵育和洗涤步骤，需要大量的动手操作和分析时间，样品检测通量非常有限；② 动态范围很窄（±100 ng/mL），在 DSP 研究期间需要进行大量的重复检测。这使得 ELISA 不能作为一种有效的分析支持来满足 DSP 开发团队日益增长的通量要求，因此该技术的自动化是极为必要的。

Gyrolab 工作站是基于微流控技术的免疫分析平台，将微孔板内的免疫反应体系微缩到纳升级的 CD 微结构中。每片 CD 被分成 96 个微结构，每个微结构中有包被链霉亲和素的亲和微珠，通过生物素标记的捕获试剂和荧光标记的检测试剂来进行「夹心法」检测。Gyrolab 的优势包括样品和试剂体积要求低，更低的基质效应，更宽的动态范围（±10,000 ng/mL）以及快速获得结果等，因此被广泛用于监管环境下临床前和临床研究中的 PK/PD/TK 等^[6,7,8]。由于其高通量的巨大潜力，赛诺菲研究团队将其应用于 DSP 生物分析中，将 Bravo 自动液体处理平台（安捷伦科技）与 Gyrolab 免疫分析工作站结合起来建立了全自动化高通量分析平台，以有效应对生物制品 DSP 开发中 HCP 检测的挑战。下文将说明这一平台与 ELISA 标准方法的可比性，并通过比较赛诺菲三个生物制品研发基地的结果以展示该平台在实际应用中的性能。

材料和方法

案例 1 - 10：所有案例中的样品均为赛诺菲内部产品，是由 CHO 细胞表达生产的单克隆抗体和片段。
ELISA 检测：Cygnus Technologies 公司 Cygnus F550 CHO-HCP ELISA 试剂盒，BioTek ELx50 洗板机，Molecular Devices M5e 分光光度计（450nm），由 Softmax Pro 软件进行数据处理。该 ELISA 方法作为本研究的参考方法。
Gyrolab 检测：Gyrolab xP 免疫分析工作站，Bioaffy 1000 High Capacity CD，Gyrolab CHO-HCP #1 试剂盒，Gyrolab CHO-HCP 3 G 试剂盒，由 Gyrolab Evaluator 软件控制和处理数据。
样品稀释：由安捷伦科技 Bravo 自动液体处理系统自动进行，V-Work 软件（12.3.0 版）用于控制和编程。

检测方法开发与验证

Gyrolab CHO-HCP 试剂盒是「交钥匙」即用型试剂盒，使用标记的山羊抗 CHO-HCP 多克隆抗体作为捕获和检测试剂，以夹心法形式进行检测。该抗体试剂与 ELISA 方法中所使用的试剂为同一供应商的相同试剂。在 Bioaffy HC CD 上进行的检测结果表明，该方法定量限 LoQ 为 3.2 ng/mL，且在多次评估实验中一直保持一致。因此该方法对低 HCP 含量的样品检测具有足够的灵敏度和稳健性，并与 ELISA 参考结果（LoQ 约 3 ng/mL）有很好的相关性（Figure 1）。



接下来，对 Gyrolab CHO-HCP 检测方法进行验证，以确保该方法适用于预期用途。验证方案采用与 ELISA 相同的方法和可接受标准。基于已建立的产品/工艺知识和样品的可用性，在模型适用性（suitability）、专属性（specificity）、准确性（accuracy）、稀释线性度（linearity）、定量限（LoQ）、检测限（LoD）、重复性（intra-assay precision）和中间精密度（inter-assay precision）等方面对 Gyrolab 检测方法进行了验证。如表 1 所示，验证方案中规定的所有验收标准均被满足。



Gyrolab 检测结果与 ELISA 比较

在六个项目（case 2 - 7）中对 Gyrolab 高通量 HCP 检测方法和 ELISA 方法进行了平行比较，这六个项目代表了赛诺菲集团内开发的药物分子的多样性，包括抗体、片段和多特异性抗体。结果显示，Gyrolab 两种 CHO-HCP 试剂盒和经典 ELISA 方法的结果在总 HCP 蛋白定量和清除率上均有很好的相关性（Figure2），说明Gyrolab 技术能够在药物早期 DSP 开发过程中提供高通量支持，以减少人工操作时间、成本和重复测试需要，大幅提升分析周转效率。



Cross-site 评估

对 Gyrolab 检测方法在三个不同基地之间的稳健性进行了评估，三个基地使用同样的样品和程序进行分析，样品中 HCP 含量为 ng/mL 级。跨地点研究的结果如 Figure 4 所示，Gyrolab 方法在赛诺菲全球不同基地之间多个项目中的检测数据具有高度可比性，并且方法非常灵敏，能够检测到后续工艺步骤之间微小的变化，因此可将 Gyrolab 技术作为统一的分析平台以支持赛诺菲全球所有生物制剂开发基地的工艺开发。



自动化高通量 HCP 分析平台

上面的对比研究证明了 Gyrolab 技术的优势，其具有出色的动态范围、线性度、重复性和精密度，并与 ELISA 黄金标准方法呈现出良好的可比性。此外， Gyrolab 平台一次可以运行 5 片 CD，获得 480 个数据点，这样的高通量允许一个样品在几个稀释度下运行，以测试线性度、回收率和基质效应等。

高通量的分析模式对样品制备工作的要求很高，譬如一个 DSP DoE 有 60 个待测样品，需要 360 个不同的稀释（每个样品在三个稀释度下进行掺入实验）。为了解决样品制备瓶颈，采用安捷伦科技公司的 Bravo 自动化液体处理平台来处理大量的样品，如 Figure 6 所示。



Gyrolab 免疫分析工作站与 Bravo 自动液体处理平台相结合，实现了完全自动化的高通量分析，该流程能够在短短一天半的时间内完成所有检测并获得结果：第一天，设置好设备，使用 Bravo 自动准备和稀释样品，接下来 Gyrolab 运行过夜；第二天早上，Gyrolab 即可获得数据并进行分析。

这种自动化的高通量分析方法能够为 DSP 开发实验室提供有效的支持：① 快速的分析周转效率（1 天内即可获得结果）；②出色的检测通量（每次运行多达 90 个样品，包括两个稀释度和掺入）；③数据质量可靠，结果可重复性高。总体上，这种方法提高了生物分析部门的效率，大大减少了手工操作时间，根除了因稀释错误或人为操作误差导致的重测要求，并大幅提高了分析结果的产量、质量和可重复性。


参考文献
[1]. Petrovic S, et.al. Host-Cell Protein Analysis to Support Downstream Process Development: A High-Throughput Platform with Automated Sample Preparation. BioProcess International. November-December 2019, 17(11 - 12)
[2]. Fischer SK, et al. Specific Immune Response to Phospholipase B-Like 2 Protein, a Host Cell Impurity in Lebrikizumab Clinical Material. AAPS J. 19(1) 2017: 254–263; doi:10.1208 /s12248 - 016 - 9998 - 7.
[3]. Vanderlaan M, et al. Experience with Host Cell Protein Impurities in Biopharmaceuticals. Biotechnol. Prog. 34(4) 2018: 828 - 837;doi:10.1002 /btpr.2640.
[4]. Bee JS, et al. Trace Levels of the CHO Host Cell Protease Cathepsin D Caused Particle Formation in a Monoclonal Antibody Product. Biotechnol. Prog. 31(5) 2015: 1360– 1369; doi:10.1002 /btpr.2150.
[5]. Luo H, et al. Cathepsin L Causes Proteolytic Cleavage of CHO Expressed Proteins During Processing and Storage: Identification, Characterization, and Mitigation. Biotechnol. Prog. 35(1) 2018: e2732; doi:10.1002 /btpr.2732.
[6]. Liu R, et al. Accelerating Regulated Bioanalysis for Biotherapeutics: Case Examples Using a Microfluidic Ligand Binding Assay Platform. AAPS J. 19(1) 2017; 82–91; doi:10.1208 /s12248 - 016 - 0006 -z.
[7]. Noguchi Y, et al. Pharmacokinetics of an Intracerebroventricularly Administered Antibody in Rats. MAbs 9(7) 2017: 1210– 1215;doi:10.1080 / 19420862.2017.1345834.
[8]. Jordan G, et al. Platform Switching from ELISA to Gyrolab™: A Novel Generic Reagent Omits the Need to Change Critical Reagents. Bioanalysis 8(8) 2016: 807–814; doi:10.4155 /bio- 2015 - 0011.