肠道微生物群及其研究的重要性

肠道微生物群是指存在于胃肠道中的多样化微生物群落，它们在调节宿主健康中起着关键作用。现代科学研究表明，肠道微生物群的结构和功能变化与多种慢性疾病的发展息息相关，如代谢性疾病、炎症性肠病和结直肠癌。因此，研究这些微生物群落的遗传多样性具有重要意义。近年来，随着测序技术的进步，科学家们揭示了许多未知微生物的存在，反映出肠道微生物群的复杂性。然而，尽管测序技术提供了大量信息，基于培养的研究依然至关重要，因为它们不仅有助于正确分类和描述新微生物，还为后续的功能研究提供了可能。

 

肠道微生物分离与培养的挑战

在从复杂菌落中分离和描述微生物的过程中，高效分离单个菌落成员以生成无菌培养物是一个重要步骤。由于人类粪便中的微生物群分布不均，这一过程变得更加复杂。获得纯培养物的传统方法主要依赖于琼脂平板上的菌落划线或连续稀释过程。在连续稀释方法中，样品在微孔板中连续稀释，直到没有观察到细菌生长。虽然这种方法可以产生纯培养物，但由于只有一小部分孔能够产生微生物培养物，因此效率低且产量有限。所以，改进从复杂基质中分离单个细胞的技术，对于提高培养方法的效率至关重要。

 

B.SIGHT：一种高效的单细胞分离方法

为了解决上述问题，我们在此介绍一种快速生成肠道细菌无菌培养物的简化工作流程。绕过低效的有限稀释步骤，我们采用专为快速分选单个微生物细胞并直接生成克隆培养物而设计的B.SIGHT系统。B.SIGHT可以将单个微生物细胞分离到液体培养基或固体琼脂上。这种台式的系统也可放置在厌氧工作站中，非常适合处理厌氧菌。

 

图1. B.SIGHT系统

我们使用B.SIGHT系统，成功获得了1181个大肠杆菌和拟杆菌，以及1666个小鼠肠道细菌的克隆菌群。在最终培养物中，通过MALDI-TOF-MS鉴定了多达500个分离株，揭示了潜在的新物种的存在。此项研究不仅显著提高了培养方法的效率，还为微生物分类和功能研究奠定了坚实基础。

 

#材料和方法

 

1. 样品和培养条件

大肠杆菌和硫化杆菌菌株来源于内部细菌收集。来自小鼠肠道的复合微生物群是由先前生成的混合培养物中获取的。菌株和样本在厌氧条件下（89.3% N2, 4.7% H2, 6% CO2）于适当的培养基中进行培养。然后将细胞分配到不同的培养基中（BHI，脑心浸液；WCA，Wilkins-Chalgren厌氧培养基；GMM，肠道微生物培养基）。所有材料和培养基在开始分离工作前24小时放入厌氧工作站。

 

2. B.SIGHT单细胞分离原理

B.SIGHT专为快速、简单、温和地分离单菌株而设计，能够利用高分辨率成像技术进行微生物细胞分离。在实验中，样本首先加载到一个墨盒中，然后进入一个直径为20 µm的喷嘴。当压电传感器驱动的活塞推动硅膜时，分配芯片会迅速按需生成小液滴。在操作过程中，对分配芯片喷嘴区域连续成像。检测软件会自动分析每个经过的颗粒，确认下一个液滴中是否包含符合参数的单个细胞，只有符合条件的细胞才会被分配到下方的96孔或384孔板的一个孔中。多余的液滴，如空液滴或包含多个细胞的液滴，在分配之前会被真空去除（图2A）。每个被分配液滴在喷嘴区域采集的图像都会自动存储，以便后续验证单细胞分离的准确性（图2B）。

图2. B.SIGHT分离单个微生物原理图

 

3. 微生物单细胞分离的工作流程

工作流程如图3所示。在细胞分离之前，将单个细菌菌株或混合菌群在厌氧条件下的液体培养基中培养24小时，以获得不含肠道内容物碎片且具有足够密度的细胞悬浮液。接着，将这些培养物在补充有0.5%（w/v）蛋白胨和还原剂的过滤灭菌磷酸盐缓冲液（PBS）中进行逐级稀释。最终稀释液通过10μm膜过滤，并分配（50-70μl）到带有20μm喷嘴的无菌墨盒中，安装在B.SIGHT仪器上以进行单细胞分配。B.SIGHT仪器的准备时间通常为5-10分钟。单细胞被分配到装有液体或琼脂培养基的96孔板中。分配后，样品在37℃下孵育1至7天。液体培养基中的培养物随后转移到琼脂板上进行进一步分析。

图3. B.SIGHT分离微生物单细胞流程示意图

 

4. MALDI-TOF-MS细菌鉴定

将待鉴定的每个细胞菌落直接点到MALDI靶标上，每个样本加1μl α-氰基-4-羟基肉桂酸（HCCA）基质溶液，并在室温下干燥。最后使用Microflex LT质谱仪（Bruker Daltonics，Germany）进行MALDI-TOF测量。

 

# 结果和讨论

 

1. 单一菌株的克隆培养物

本实验旨在评估单个菌株（每个孔理论上包含一个细胞）在孔板中生长的比例。实验采用了兼性厌氧菌种大肠杆菌和严格厌氧菌种B. vulgatus，以验证该方法对严格厌氧菌的适用性。在实验中，我们处理了10个96孔板，共获得800个单细胞孔（每块板的两行孔保留为阴性对照：空液滴和培养基各保留一行）。通过OD600吸光度测量，确定了表现出生长的孔的百分比。结果显示，79.1±4.0%的孔对大肠杆菌呈阳性，68.5±5.3%的孔对B. vulgatus呈阳性（图4a）。

图4. 单细胞分配实验的输出结果

 

2. 从复杂小鼠肠道样品中分离的单个细菌的鉴定

本实验通过处理小鼠肠道复杂群落来评估其细菌多样性。对于样品1，将单细胞分配到六个固体琼脂平板和九个液体培养平板上，共计1200个孔。克隆效率即生长孔的比例，达到了87.6%（图4a）。而样品2，共使用七个固体琼脂平板和三个液体培养平板，总计800个孔，单克隆比例为77.8%（图2a）。孵育后，使用MALDI生物型测定技术对培养物进行鉴定。样品1的分析结果表明，经处理的465个分离株中至少包含八个不同的物种（图4b）。样品2则揭示了620个分离株，至少分属于12个物种（图4b）。在两个样品中，均发现了与MALDI数据库不匹配的培养物，可能代表了小鼠肠道微生物群中的未知物种。

 

# 实验结论

本文介绍了一种高通量培养工作流程，能够生成大量单克隆培养物用于下游鉴定。B.SIGHT系统在单细胞分配到液体培养基和固体琼脂上的过程中表现出高度灵活性，并配备图像确认功能，使整个操作过程更加可靠和可控。

 

B.SIGHT系统占地面积小，能够方便地放置在厌氧室和层流罩中进行实验，这进一步增强了其应用范围和适应性。利用B.SIGHT，已经成功获得了2800个单克隆的培养物。

 

尽管本文的研究重点是肠道微生物群，但通过适当调整培养条件，这一方法也可以便捷地应用于其他类型的微生物环境。因此，这种高通量培养工作流程被视为研究并培养复杂微生物种群快速且有效的方法，不仅提高了实验的效率和产出质量，还为多种微生物的研究提供了强大工具，为相关科学研究奠定了坚实基础。

 

B.SIGHT用户案例

经典的琼脂平板（CAP）方法虽然广泛用于研究微生物群落，但其耗时颇长。相比之下，单细胞分配（SCD）方法则允许高通量、无标记地分选微生物。德国亚琛工业大学研究团队借助B.SIGHT系统开发了一种新的厌氧SCD方案，用于培养人类肠道细菌，并通过粪便样本在三种富营养培养基上，与CAP方法进行了对比。实验结果显示，新的厌氧SCD方法将单克隆培养物的获得时间从17天缩短至5天，同时其分离细菌的多样性和相对丰度在覆盖率与CAP方法相当。

 

此外，研究团队还测试了总捕获部分，对2400个分配的单细胞在生长后直接进行测序，分析未标识单个菌株的体积生物量。结果显示，SCD方法的培养分数从35.2%提升至52.2%，展示了单样本在深层培养项目中的潜力。基于SCD的培养还获得了未检测到的物种，每个样本平均发现16种未知微生物，其中包括7个新分类群。

 

此研究覆盖了5个门（放线菌门、拟杆菌门、脱硫菌门、厚壁菌门和变形菌门）、24个科的82种人类肠道细菌，其中包含11个新属和10个新物种的第一个培养菌。这为微生物培养和研究提供了新的视角和方法。

图5. 德国亚琛工业大学研究团队研究论文

图6. SCD和CAP厌氧培养的比较

 

未来展望

B.SIGHT技术在厌氧肠道细菌分离工作中带来了革命性的变化。凭借其高效、精准和高通量的特性，B.SIGHT不仅显著提升了研究效率，还为合成生物学和微生物组学的研究开辟了新的可能性。这一突破性工具无疑为相关领域的研究人员提供了充分的便利和潜力。如果您也从事相关领域的研究，B.SIGHT绝对是您值得尝试的强大工具。它不仅能加速您的研究进展，还能为您提供更为精确和可靠的实验结果。

 

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