嵌合抗原受体（CAR-T）细胞疗法在治疗包括实体瘤在内的各种癌症方面具有很大的前景。但是科学家也发现，对CAR-T治疗血癌和实体瘤的行为以及有效性进行建模一直具有挑战性，这是因为癌细胞具有独特的肿瘤微环境。肿瘤微环境（TME）的特征通常为缺氧、酸度增加和高间质液压，这使癌症细胞能够有效逃避免疫监测。这种免疫抑制性TME也会导致CAR-T细胞耗竭，从而限制其抗肿瘤活性和功能。

图1.AVATAR模拟细胞肿瘤微环境

 

为了解决这些问题，我们开发了一种新的基于细胞的检测方法，在三维（3D）体外细胞培养系统、人类急性B细胞淋巴细胞白血病小鼠模型和免疫抑制肿瘤微环境中测量CAR-T细胞的效力和细胞毒性功能。利用这个独特设计的体外培养系统（AVATAR），我们再现了在脉管系统、骨髓和实体瘤微环境中发现的氧气和间质流体压力，然后通过流式细胞术和电阻抗等技术分析细胞耗竭进而测定在这些环境下的肿瘤细胞溶解，并通过进行一系列肿瘤激发试验来检测了CAR-T抗肿瘤的活力和有效性。

图2.使用AVATAR提供加压TME培养条件

 

结果展示

1.加压TME条件增强病毒转导，增加CD19 CAR-T+细胞总数

用CD19-CAR慢病毒转染活化的T细胞，并在标准培养箱或AVTAR培养箱中培养7天，然后通过流式细胞术进行分析。在AVTAR系统中生长的细胞显示出5-7%的转导效率增加以及20%的生长能力增加。

图3.CD19-CAR-T细胞的特性

 

2.TME条件提高了CAR-T扩增率，增加了CD19 CAR-T+细胞的总数

将相同数量的CD19-CAR-T细胞（5.0E+05）在不同的O2%和压力条件下培养11天，并用AO/PI方法每天计数细胞数量。在培养期结束时，在低压/缺氧条件下（CAR-T 15%O2+0 PSI）的AVATAR培养箱中的细胞具有最高的生长速率。

图4.CD19-CAR-T细胞生长曲线

 

3.靶向肿瘤杀伤试验中加压TME条件提高CD19-CAR-T的存活率

CAR-T细胞与靶细胞（NALM6或MV-4-11，5.0E+04/孔）以不同的E:T比共培养20h，然后通过流式细胞术分析细胞毒性，收集细胞上清液进行IFN-γ定量。与正常培养箱相比，在AVATAR培养箱中培养的CAR-T细胞具有更高的靶细胞杀伤能力，但在这些组中未检测到IFN-γ分泌的变化。

图5.CD19-CAR-T杀伤试验的细胞毒性和细胞因子结果

 

4.靶向肿瘤杀伤试验中加压TME条件维持CD19 CAR-T的效力

CD19 CAR-T细胞在Normoxic（21%O2+0PSI）或TME（AVTAR:1%O2+2PSI）培养条件下扩增。CD19 CAR-T细胞对NALM6的杀伤是在Normoxic或TME条件下进行的。与ST162供体来源的CD19 CAR-T细胞相比，ST164供体来源的CD19 CAR-T细胞显示出10%的细胞毒性增加。供体来源的CAR -Ts在CD4/8人群中表现出显著的变化，向CD4人群倾斜。有趣的是，更高的E:T比率并没有导致更多的目标杀伤。

图6.在共培养中CD19 CAR-T特异性杀伤NALM6细胞

 

5.在一系列肿瘤激发试验中加压TME条件增强ROR1 CAR-T效力

图7.一系列肿瘤激发试验中不同TME条件下ROR1 CAR-T的效力

 

6.免疫抑制TME筛选条件下加压TME条件增强ROR1 CAR-T效力

肿瘤细胞溶解测定：将靶细胞SKOV3（ATCC）以每孔5K个细胞（96孔形式）接种。在效应细胞（ROR1 CAR-T细胞）以10∶1的效靶比（50K）引入之前，使靶细胞粘附24小时。在Normoxia（21%O2&0pSI）或TME（1%O2&2PSI）下进行细胞杀伤测定。在CO2培养箱或AVTAR系统（环境O2+4PSI）中转导ROR1 CAR-T细胞并扩增9天。在共培养48小时后进行IFN-γ分泌测定（BD cat#555142）。使用BD Fortessa X-20对Naïve cells（CCR7+CD45RA+）、中央记忆（CCR7+CD45RA-）、效应记忆（CCF7-CD45RA-）进行流式细胞术检测。

图8.肿瘤细胞溶解测定

 

我们使用靶向卵巢腺癌细胞系SKOV3的抗受体酪氨酸激酶样孤儿受体1（ROR1）CAR-T细胞进行了概念验证实验。CD19 CAR-T被用来靶向急性淋巴细胞白血病细胞系NALM6。我们评估了效应T细胞与肿瘤细胞的特定比例，以模拟体外CAR-T的效力，并且通过效应T细胞对肿瘤细胞的比率的增加证实了CD19 CAR-T介导的细胞毒性的升高。这些筛选实验的初步结果显示，在TME条件下，ROR1 CAR-T介导的细胞毒性显著下降，CD19 CAR-T表现出有效的细胞杀伤力。我们还发现了有趣的一点，在高压和低氧培养（AVTAR）条件下，ROR1 CAR-T细胞效力水平明显提高，这值得进一步研究。

 

关于AVATAR

个体化细胞控制系统AVATAR可以自由控制培养环境中的氧气含量和压力强度，在体外精准模拟出加压和缺氧的肿瘤微环境条件，使研究人员能够在接近真实的环境中研究药物作用机制、评估治疗效果，得到更加科学的结果，同时也减少项目的优化时间与成本费用。