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前沿进展|纳米级分辨率显微镜Nanoimager在结缔组织疾病中的应用
525 人阅读发布时间：2023-03-27 15:27
宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的研究人员在研究结缔组织内因肌腱炎而恶化的细胞时发现，当细胞所处的微环境发生病变时，会导致染色质产生空间和密度的不可逆变化，使其无法正常编码遗传信息。这项研究结果于2022年8月22日发表在Nature Biomedical Engineering上，指出了新疗法（例如小分子疗法）的可能性。
染色质空间组织变化大多发生在纳米尺度上（10-100nm），使用传统的荧光显微镜来研究这一现象一直具有挑战性。虽然基于高通量染色体构象捕获的方法能够提供关于基因组组织有价值的信息，但这种方法通常需要大量的细胞，掩盖了细胞间的异质性。
在此研究中，作者使用Nanoimager单分子成像与功能分析系统，获得了染色质结构的纳米级高分辨率图像，确定了结缔组织的微观化学物理环境在纳米尺度上如何调节染色质的组织变化，为治疗结缔组织疾病提供了新的治疗策略。
研 究 结 果
1. 组织恶化改变hTCs的染色质组织
已知组织恶化或衰老会改变致密结缔组织的力学环境，因此作者使用超分辨率成像和定量分析来确定衰老和组织恶化是否会导致基因组组织的改变。
从三种不同供体（1.健康的年轻人、2.已确诊肌腱病的年轻人、3.健康的老年人）的人体肌腱中分离出肌腱细胞（hTCs），超分辨率图像显示，健康年轻人的hTCs细胞核中，染色质分布在整个细胞核中。然而，组蛋白H2B 出人意料地主要定位于已确诊肌腱病的年轻人hTCs细胞核的核外周。为进一步量化不同细胞类型中的染色质组织，使用图像分割软件Voronoi进行细分，结果显示，与健康hTCs相比，无论核外围还是核内部的染色质，病变hTCs的稀疏和致密染色质间室都更加紧凑。这些数据表明，组织恶化和衰老都影响hTCs中染色质组织的空间不同模式。
图1.（a）5um和300nm标尺下的H2B 的STORM图像。（b）单位面积内组蛋白H2B在核边界和核内部区域内的定位数量比例。（c）是（a）中的组蛋白H2B经Voronoi渲染后的数据，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（d）年轻、肌腱病和老年供体hTCs致密染色质室中染色质凝缩的变化。
2. 基质刚度改变hMSCs中的染色质组织
组织(包括肌腱组织)具有很大的刚度范围，组织变性能改变细胞外基质（ECM）的化学物理环境。因此，作者假设，病变hTCs(或其祖细胞)基因组组织的变化可能是由恶化的组织微环境中的异常化学-力学信号驱动的，特别是由组织刚度的变化引起的。
为了评估生理和病理相关的生物物理信号如何在纳米尺度上影响基因组组织，作者选择了人间充质干细胞（hMSCs）这种可以根据基质刚度来适应表型的细胞，用这些在不同基质上培养的模型细胞来优化染色质的定量超分辨率成像，并记录不同的基因组组织的变化。数据表明，基质刚度在纳米尺度上调控了hMSCs的染色质在空间上的组织和凝缩。
图2.（a）培养在三种不同基质上的hMSCs内组蛋白H2B的STORM图像。在Stiff和Glass两组里，H2B在核内分布更为均一，而在Soft组里，H2B则更多分布于核外围。（b）单位面积内组蛋白H2B在核边界和核内部区域内的定位数量比例。（c）是（a）中的组蛋白H2B经Voronoi渲染后的数据，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（d）三种不同基质上hMSCs细胞核致密染色质室染色质凝缩的变化
3. 基质刚度改变hMSCs的组蛋白甲基化水平
接着，作者研究了基质刚度是否也会导致活性染色质（标记物为H3K4me3）和异染色质（标记物为H3K27me3）的定位和凝缩状态的变化。
作者用两种特定组蛋白修饰的抗体对hMSCs进行标记，并获得了三种基质条件下的超分辨率图像。H3K4me3的热图和定量分析表明，与玻璃基质培养的hMSCs相比，在硬基质培养的hMSCs中H3K4me3的水平略有升高，而在软基质培养的hMSCs中，H3K4me3的水平显著降低。这些数据与前面描述的H2B凝缩分析一致，表明活性组蛋白标记的丢失与软基质上染色质凝缩的增加相关。相反，与玻璃基质相比，H3K27me3在硬基质上的含量较低(特别是在核内部)，而在软基质上的含量较高(特别是在核外围)。这些结果表明，外周染色质定位的增加和软基质上染色质凝缩的增加与H3K27me3水平的增加进一步相关，这表明软基质可能导致基因抑制。
在观察到基质刚度在纳米尺度上调控染色质的组织，以及基质依赖性染色质重构与组蛋白甲基化标记水平的变化相关后，作者进一步研究了zeste同源物2 (EZH2，催化H3K27me3)的甲基转移酶增强子的作用，数据表明基质刚度通过改变hMSCs中的细胞收缩力和组蛋白甲基化状态来调节染色质的空间组织和凝缩。
图3.（a）和（c）分别是H3K4me3和H3K27me3的STORM图像。（b）和（d）是在不同的基质上培养的hMSCs中，在单位面积内在核边界和核内部区域内H3K4me3和H3K27me3的定位数量比例。（e）是三种不同基质上培养的经GSK和不经GSK处理的hMSCs细胞核中组蛋白H2B数据，经Voronoi渲染后，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（f）使用和不使用GSK处理时，核边界和核内区域之间H2B定位的变化被量化为核边界单位面积上H2B定位的数量与核内区域单位面积上H2B定位的总数之比。（g）与对照组hMSCs相比，GSK处理的hMSCs中致密染色质凝缩水平的变化。
4. 染色质重构的预测
异染色质的形成以前被认为是多种机制的结果，包括染色质和染色质相关蛋白（如HP1α）的液-液相分离、连接蛋白组蛋白H1中和静电电荷和转录沉默。如前所述，已知特定的表观遗传标记与浓缩异染色质或开放性常染色质相关。然而，表观遗传调控因子对染色质组织的影响尚未完全了解，乙酰化和甲基化的动力学是否能改变染色质的凝缩尚不清楚。为了探索这些，并确定观察到的基质刚度对染色质凝缩的影响是否是组蛋白甲基化状态变化的结果，作者开发了一个模拟异染色质形成的相场模型。这个模型概括了组蛋白甲基化水平的基质依赖性变化如何影响细胞核染色质的空间组织的实验结果，为乙酰化和甲基化水平与相分离竞争并影响染色质组织提供了数据支持。
图4.（a）甲基化的增加对染色质组织的影响，蓝色和红色分别代表常染色质和异染色质富集的区域。（b）异染色质簇的大小与甲基化水平的比例关系。（c）核边界异染色质结构域（BHDs）厚度与甲基化水平的比例关系。（d）在软或硬基质上培养的细胞，实验测量和模型预测的核边界和核内部异染色质百分比。左边图像对应的是前图中按照Voronoi多边形大小编码的H2B颜色的STORM图像。右边的图像与模型预测相对应，蓝色为常染色质，红色为异染色质。（e）在软基质上培养的经GSK343处理或不经GSK343处理的细胞，实验测量和模型预测的核边界和核内部异染色质百分比。左边图像对应的是前图中按照Voronoi多边形大小编码的H2B颜色的实验STORM图像。右边的图像与模型预测相对应，蓝色为常染色质，红色为异染色质。
5. 染色质在动态力学信号下快速重组
现有数据表明，基质刚度通过影响细胞相容性和下游甲基转移酶活性来改变染色质的组织和定位，但这种静态时不变的力学信号不能复制主动负载细胞环境中重构的动态和时变特征。因此，作者接下来研究了生物物理环境的动态变化如何影响hMSC的细胞核在纳米尺度上的染色质组织。作者使用原位基质增强系统来评估人骨髓间充质干细胞中H2B纳米空间组织和染色质凝缩的变化。细胞在“硬化水凝胶”系统上培养，该系统提供了基质刚度从软（约3kPa）到硬（约30kPa）的力学状态的快速变化。H2B密度的热图显示，硬化后的最初6小时，染色质主要定位于核周边，硬化后6～48h，染色质从核周边向核内部不断重新分布。染色质空间组织的这些变化伴随着稀疏和致密染色质室的凝缩状态的持续下降。
有趣的是，硬化后2h开始凝缩变化，因此在空间组织变化之前，这表明染色质的解聚可能导致其在细胞核中的空间重构。硬化后18小时，解凝缩量达到起始值的60%左右，并持续至第7天。作者接下来研究了肌动球蛋白驱动的收缩力在染色质组织和响应基质硬化的缩合中的作用。数据表明，ECM-硬化介导的染色质解致密化和从hMSC细胞核边界到内部的再分布需要肌动球蛋白为基础的细胞收缩。总之，这些数据表明，动态生物物理扰动以复杂而快速的方式调节hMSCs细胞核中的纳米尺度的染色质组织。
图5.（a）硬化后0-48h，组蛋白H2B从核外围到核内部连续重分布的STORM图像。（b）核边界H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比值。（c）硬化后0-48h，hMSCs内致密染色质室中染色质凝缩的变化。（d）在加/不加Y27处理硬化后不同时间的水凝胶上培养的hMSCs，单位面积核边界H2B定位总数与核内部H2B定位总数之比，表明Y27在硬化后阻止了染色质从核边界到核内部的重新定位。（e）在加/不加Y27的硬化水凝胶上培养的hMSCs中致密染色质室染色质凝缩的变化，Y27处理可防止硬化后致密染色质凝缩随时间的减少。（f）示意图显示ECM硬化如何通过肌动球蛋白为基础的细胞收缩来调节hMSCs中的染色质分布和凝缩。ECM硬化使染色质从边界重新分布到hMSC核的内部区域，导致染色质去凝，这需要细胞的收缩。
6. “恶化”信号改变hTCs的染色质组织
鉴于生物物理信号对体外纳米尺度上染色质组织的影响的结果，作者接下来提出了初步假设：化学物理环境（例如软ECM、缺氧和炎症）的恶化信号可能引起纳米尺度上染色质重构，并导致年轻健康的hTCs呈现与老年或恶化的（肌腱病）hTCs相似的特征。为了验证这一假设，作者首先在玻璃、硬（30kPa）或软（3kPa）基质上在基础生长培养基中培养从年轻健康供体分离的hTCs 2天。超分辨图像再次显示了H2B定位，在玻璃基质上培养的年轻健康hTCs的细胞核中形成明显的H2B纳米结构域。有趣的是，年轻hTCs在硬基质上培养时，整个细胞核中稀疏和浓缩的染色质室的染色质凝缩减少，达到与在玻璃基质上培养的老年hTCs相似的水平。而在软基底上培养时，染色质重新定位到核周边并变得更加致密，特别是在核内部，这与恶化的hTCs相似。总的来说，这些数据表明，肌腱老化或微损伤引起的组织力学性质改变可能会导致疾病中染色质组织的一些异常变化。
图6.（a）培养在三种不同基质上的hTCs内组蛋白H2B的STORM图像。（b）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示在软基质上培养的hTCs中H2B重新定位到核边界。（c）组蛋白H2B的STORM图像，展示在常氧条件下年轻的和肌腱病的hTCs中H2B的定位变化，以及在低氧条件下年轻的hTCs中的H2B定位变化。（d）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比值，显示缺氧条件下年轻hTCs中H2B重新定位到核边界。（e）组蛋白H2B的STORM图像，展示的是在有/没有IL-1β和TNF-α的玻璃基质上培养的hTCs中H2B定位的变化。（f）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示hTCs在经炎症因子处理后H2B的重新定位到核边界。
7. 恶化影响hTCs的力学灵敏度
鉴于hTCs能够通过改变染色质的空间组织和凝缩来迅速应对力学环境的变化，作者最后研究了组织恶化或老化如何影响其力学敏感性。超分辨成像结果显示，年轻、肌腱病和老年hTCs中的H2B在硬化后4小时内主要定位于核周边。硬化24小时后，年轻hTCs中的染色质在整个细胞核中变得更均匀地分散和去致密。老化细胞对基质刚度的增加也有相同的反应趋势，但在染色质解致密化方面程度较低。然而，当肌腱病变细胞在硬化的水凝胶上培养时，染色质的空间组织没有变化，特别是在核周边染色质失活的程度，与年轻和老年细胞相比明显更低。这些数据表明，hTCs染色质组织的长期改变可能与恶化引起的力学灵敏性丧失有关。
图7. （a）硬化后4h和24h，不同组的hTCs组蛋白H2B分布的STORM图像。（b）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示在肌腱病组的hTCs在基质硬化后H2B重新定位到核内部的过程没有及时反应。（c）硬化24 h后致密染色质室中染色质凝缩的变化。
研 究 结 论
在这项研究中，基于强大的超分辨率显微镜Nanoimager，作者在纳米尺度上展示了健康纤维组织和祖细胞细胞核中染色质组织对力学性能具有高度的响应性，这种响应性依赖于独特的细胞骨架网络和组蛋白修饰的动态变化，这对如何以及何时应用临床疗法治疗人类疾病具有重要的指导意义。
图8.基质的高硬度改变了以肌动球蛋白为基础的细胞收缩性，从而促进肌动蛋白应力纤维的形成和局部粘附，并调节染色质修饰物(例如HDAC和EZH2)进出细胞核。这些表观遗传修饰物通过调节组蛋白乙酰化/甲基化水平改变染色质在纳米尺度上的空间组织和凝缩。
Nanoimager
Nanoimager作为新一代单分子成像系统的标志性代表，相比传统的荧光显微镜，在技术的先进性方面具有巨大突破。它克服了光衍射的限制，横向分辨率可达20nm、轴向分辨率可达50nm，并支持同时双色成像和顺序四色成像，可在空间上对形态学和亚细胞动态进行精确的纳米级研究，进一步揭示分子相互作用细节，使深入探索变得更简单。
Nanoimager 集成多种高端成像技术于一体，具备dSTORM（随机光学重建显微技术）、PALM（光激活定位显微技术）、Single Particle Tracking（单分子动态追踪与定量）、smFRET（单分子FRET技术）和Confocal（共聚焦技术）等技术模块，这些优势使它成为信号通路转导、肿瘤和外泌体标志物、病毒增殖和装配、细胞亚显微结构表征等研究领域在单分子水平上进行显微分析的重要帮手。
染色质空间组织变化大多发生在纳米尺度上（10-100nm），使用传统的荧光显微镜来研究这一现象一直具有挑战性。虽然基于高通量染色体构象捕获的方法能够提供关于基因组组织有价值的信息，但这种方法通常需要大量的细胞，掩盖了细胞间的异质性。
在此研究中，作者使用Nanoimager单分子成像与功能分析系统，获得了染色质结构的纳米级高分辨率图像，确定了结缔组织的微观化学物理环境在纳米尺度上如何调节染色质的组织变化，为治疗结缔组织疾病提供了新的治疗策略。
研 究 结 果
1. 组织恶化改变hTCs的染色质组织
已知组织恶化或衰老会改变致密结缔组织的力学环境，因此作者使用超分辨率成像和定量分析来确定衰老和组织恶化是否会导致基因组组织的改变。
从三种不同供体（1.健康的年轻人、2.已确诊肌腱病的年轻人、3.健康的老年人）的人体肌腱中分离出肌腱细胞（hTCs），超分辨率图像显示，健康年轻人的hTCs细胞核中，染色质分布在整个细胞核中。然而，组蛋白H2B 出人意料地主要定位于已确诊肌腱病的年轻人hTCs细胞核的核外周。为进一步量化不同细胞类型中的染色质组织，使用图像分割软件Voronoi进行细分，结果显示，与健康hTCs相比，无论核外围还是核内部的染色质，病变hTCs的稀疏和致密染色质间室都更加紧凑。这些数据表明，组织恶化和衰老都影响hTCs中染色质组织的空间不同模式。
图1.（a）5um和300nm标尺下的H2B 的STORM图像。（b）单位面积内组蛋白H2B在核边界和核内部区域内的定位数量比例。（c）是（a）中的组蛋白H2B经Voronoi渲染后的数据，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（d）年轻、肌腱病和老年供体hTCs致密染色质室中染色质凝缩的变化。2. 基质刚度改变hMSCs中的染色质组织
组织(包括肌腱组织)具有很大的刚度范围，组织变性能改变细胞外基质（ECM）的化学物理环境。因此，作者假设，病变hTCs(或其祖细胞)基因组组织的变化可能是由恶化的组织微环境中的异常化学-力学信号驱动的，特别是由组织刚度的变化引起的。
为了评估生理和病理相关的生物物理信号如何在纳米尺度上影响基因组组织，作者选择了人间充质干细胞（hMSCs）这种可以根据基质刚度来适应表型的细胞，用这些在不同基质上培养的模型细胞来优化染色质的定量超分辨率成像，并记录不同的基因组组织的变化。数据表明，基质刚度在纳米尺度上调控了hMSCs的染色质在空间上的组织和凝缩。
图2.（a）培养在三种不同基质上的hMSCs内组蛋白H2B的STORM图像。在Stiff和Glass两组里，H2B在核内分布更为均一，而在Soft组里，H2B则更多分布于核外围。（b）单位面积内组蛋白H2B在核边界和核内部区域内的定位数量比例。（c）是（a）中的组蛋白H2B经Voronoi渲染后的数据，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（d）三种不同基质上hMSCs细胞核致密染色质室染色质凝缩的变化
3. 基质刚度改变hMSCs的组蛋白甲基化水平
接着，作者研究了基质刚度是否也会导致活性染色质（标记物为H3K4me3）和异染色质（标记物为H3K27me3）的定位和凝缩状态的变化。
作者用两种特定组蛋白修饰的抗体对hMSCs进行标记，并获得了三种基质条件下的超分辨率图像。H3K4me3的热图和定量分析表明，与玻璃基质培养的hMSCs相比，在硬基质培养的hMSCs中H3K4me3的水平略有升高，而在软基质培养的hMSCs中，H3K4me3的水平显著降低。这些数据与前面描述的H2B凝缩分析一致，表明活性组蛋白标记的丢失与软基质上染色质凝缩的增加相关。相反，与玻璃基质相比，H3K27me3在硬基质上的含量较低(特别是在核内部)，而在软基质上的含量较高(特别是在核外围)。这些结果表明，外周染色质定位的增加和软基质上染色质凝缩的增加与H3K27me3水平的增加进一步相关，这表明软基质可能导致基因抑制。
在观察到基质刚度在纳米尺度上调控染色质的组织，以及基质依赖性染色质重构与组蛋白甲基化标记水平的变化相关后，作者进一步研究了zeste同源物2 (EZH2，催化H3K27me3)的甲基转移酶增强子的作用，数据表明基质刚度通过改变hMSCs中的细胞收缩力和组蛋白甲基化状态来调节染色质的空间组织和凝缩。
图3.（a）和（c）分别是H3K4me3和H3K27me3的STORM图像。（b）和（d）是在不同的基质上培养的hMSCs中，在单位面积内在核边界和核内部区域内H3K4me3和H3K27me3的定位数量比例。（e）是三种不同基质上培养的经GSK和不经GSK处理的hMSCs细胞核中组蛋白H2B数据，经Voronoi渲染后，红色是小的Voronoi多边形，具有较高的组蛋白 H2B密度；蓝色是大的Voronoi多边形，具有较低的组蛋白 H2B密度。（f）使用和不使用GSK处理时，核边界和核内区域之间H2B定位的变化被量化为核边界单位面积上H2B定位的数量与核内区域单位面积上H2B定位的总数之比。（g）与对照组hMSCs相比，GSK处理的hMSCs中致密染色质凝缩水平的变化。
4. 染色质重构的预测
异染色质的形成以前被认为是多种机制的结果，包括染色质和染色质相关蛋白（如HP1α）的液-液相分离、连接蛋白组蛋白H1中和静电电荷和转录沉默。如前所述，已知特定的表观遗传标记与浓缩异染色质或开放性常染色质相关。然而，表观遗传调控因子对染色质组织的影响尚未完全了解，乙酰化和甲基化的动力学是否能改变染色质的凝缩尚不清楚。为了探索这些，并确定观察到的基质刚度对染色质凝缩的影响是否是组蛋白甲基化状态变化的结果，作者开发了一个模拟异染色质形成的相场模型。这个模型概括了组蛋白甲基化水平的基质依赖性变化如何影响细胞核染色质的空间组织的实验结果，为乙酰化和甲基化水平与相分离竞争并影响染色质组织提供了数据支持。
图4.（a）甲基化的增加对染色质组织的影响，蓝色和红色分别代表常染色质和异染色质富集的区域。（b）异染色质簇的大小与甲基化水平的比例关系。（c）核边界异染色质结构域（BHDs）厚度与甲基化水平的比例关系。（d）在软或硬基质上培养的细胞，实验测量和模型预测的核边界和核内部异染色质百分比。左边图像对应的是前图中按照Voronoi多边形大小编码的H2B颜色的STORM图像。右边的图像与模型预测相对应，蓝色为常染色质，红色为异染色质。（e）在软基质上培养的经GSK343处理或不经GSK343处理的细胞，实验测量和模型预测的核边界和核内部异染色质百分比。左边图像对应的是前图中按照Voronoi多边形大小编码的H2B颜色的实验STORM图像。右边的图像与模型预测相对应，蓝色为常染色质，红色为异染色质。
5. 染色质在动态力学信号下快速重组
现有数据表明，基质刚度通过影响细胞相容性和下游甲基转移酶活性来改变染色质的组织和定位，但这种静态时不变的力学信号不能复制主动负载细胞环境中重构的动态和时变特征。因此，作者接下来研究了生物物理环境的动态变化如何影响hMSC的细胞核在纳米尺度上的染色质组织。作者使用原位基质增强系统来评估人骨髓间充质干细胞中H2B纳米空间组织和染色质凝缩的变化。细胞在“硬化水凝胶”系统上培养，该系统提供了基质刚度从软（约3kPa）到硬（约30kPa）的力学状态的快速变化。H2B密度的热图显示，硬化后的最初6小时，染色质主要定位于核周边，硬化后6～48h，染色质从核周边向核内部不断重新分布。染色质空间组织的这些变化伴随着稀疏和致密染色质室的凝缩状态的持续下降。
有趣的是，硬化后2h开始凝缩变化，因此在空间组织变化之前，这表明染色质的解聚可能导致其在细胞核中的空间重构。硬化后18小时，解凝缩量达到起始值的60%左右，并持续至第7天。作者接下来研究了肌动球蛋白驱动的收缩力在染色质组织和响应基质硬化的缩合中的作用。数据表明，ECM-硬化介导的染色质解致密化和从hMSC细胞核边界到内部的再分布需要肌动球蛋白为基础的细胞收缩。总之，这些数据表明，动态生物物理扰动以复杂而快速的方式调节hMSCs细胞核中的纳米尺度的染色质组织。
图5.（a）硬化后0-48h，组蛋白H2B从核外围到核内部连续重分布的STORM图像。（b）核边界H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比值。（c）硬化后0-48h，hMSCs内致密染色质室中染色质凝缩的变化。（d）在加/不加Y27处理硬化后不同时间的水凝胶上培养的hMSCs，单位面积核边界H2B定位总数与核内部H2B定位总数之比，表明Y27在硬化后阻止了染色质从核边界到核内部的重新定位。（e）在加/不加Y27的硬化水凝胶上培养的hMSCs中致密染色质室染色质凝缩的变化，Y27处理可防止硬化后致密染色质凝缩随时间的减少。（f）示意图显示ECM硬化如何通过肌动球蛋白为基础的细胞收缩来调节hMSCs中的染色质分布和凝缩。ECM硬化使染色质从边界重新分布到hMSC核的内部区域，导致染色质去凝，这需要细胞的收缩。
6. “恶化”信号改变hTCs的染色质组织
鉴于生物物理信号对体外纳米尺度上染色质组织的影响的结果，作者接下来提出了初步假设：化学物理环境（例如软ECM、缺氧和炎症）的恶化信号可能引起纳米尺度上染色质重构，并导致年轻健康的hTCs呈现与老年或恶化的（肌腱病）hTCs相似的特征。为了验证这一假设，作者首先在玻璃、硬（30kPa）或软（3kPa）基质上在基础生长培养基中培养从年轻健康供体分离的hTCs 2天。超分辨图像再次显示了H2B定位，在玻璃基质上培养的年轻健康hTCs的细胞核中形成明显的H2B纳米结构域。有趣的是，年轻hTCs在硬基质上培养时，整个细胞核中稀疏和浓缩的染色质室的染色质凝缩减少，达到与在玻璃基质上培养的老年hTCs相似的水平。而在软基底上培养时，染色质重新定位到核周边并变得更加致密，特别是在核内部，这与恶化的hTCs相似。总的来说，这些数据表明，肌腱老化或微损伤引起的组织力学性质改变可能会导致疾病中染色质组织的一些异常变化。
图6.（a）培养在三种不同基质上的hTCs内组蛋白H2B的STORM图像。（b）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示在软基质上培养的hTCs中H2B重新定位到核边界。（c）组蛋白H2B的STORM图像，展示在常氧条件下年轻的和肌腱病的hTCs中H2B的定位变化，以及在低氧条件下年轻的hTCs中的H2B定位变化。（d）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比值，显示缺氧条件下年轻hTCs中H2B重新定位到核边界。（e）组蛋白H2B的STORM图像，展示的是在有/没有IL-1β和TNF-α的玻璃基质上培养的hTCs中H2B定位的变化。（f）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示hTCs在经炎症因子处理后H2B的重新定位到核边界。
7. 恶化影响hTCs的力学灵敏度
鉴于hTCs能够通过改变染色质的空间组织和凝缩来迅速应对力学环境的变化，作者最后研究了组织恶化或老化如何影响其力学敏感性。超分辨成像结果显示，年轻、肌腱病和老年hTCs中的H2B在硬化后4小时内主要定位于核周边。硬化24小时后，年轻hTCs中的染色质在整个细胞核中变得更均匀地分散和去致密。老化细胞对基质刚度的增加也有相同的反应趋势，但在染色质解致密化方面程度较低。然而，当肌腱病变细胞在硬化的水凝胶上培养时，染色质的空间组织没有变化，特别是在核周边染色质失活的程度，与年轻和老年细胞相比明显更低。这些数据表明，hTCs染色质组织的长期改变可能与恶化引起的力学灵敏性丧失有关。
图7. （a）硬化后4h和24h，不同组的hTCs组蛋白H2B分布的STORM图像。（b）核边界单位面积上H2B定位总数与核内区域H2B定位总数的比例，显示在肌腱病组的hTCs在基质硬化后H2B重新定位到核内部的过程没有及时反应。（c）硬化24 h后致密染色质室中染色质凝缩的变化。
研 究 结 论
在这项研究中，基于强大的超分辨率显微镜Nanoimager，作者在纳米尺度上展示了健康纤维组织和祖细胞细胞核中染色质组织对力学性能具有高度的响应性，这种响应性依赖于独特的细胞骨架网络和组蛋白修饰的动态变化，这对如何以及何时应用临床疗法治疗人类疾病具有重要的指导意义。
图8.基质的高硬度改变了以肌动球蛋白为基础的细胞收缩性，从而促进肌动蛋白应力纤维的形成和局部粘附，并调节染色质修饰物(例如HDAC和EZH2)进出细胞核。这些表观遗传修饰物通过调节组蛋白乙酰化/甲基化水平改变染色质在纳米尺度上的空间组织和凝缩。
Nanoimager
Nanoimager作为新一代单分子成像系统的标志性代表，相比传统的荧光显微镜，在技术的先进性方面具有巨大突破。它克服了光衍射的限制，横向分辨率可达20nm、轴向分辨率可达50nm，并支持同时双色成像和顺序四色成像，可在空间上对形态学和亚细胞动态进行精确的纳米级研究，进一步揭示分子相互作用细节，使深入探索变得更简单。
Nanoimager 集成多种高端成像技术于一体，具备dSTORM（随机光学重建显微技术）、PALM（光激活定位显微技术）、Single Particle Tracking（单分子动态追踪与定量）、smFRET（单分子FRET技术）和Confocal（共聚焦技术）等技术模块，这些优势使它成为信号通路转导、肿瘤和外泌体标志物、病毒增殖和装配、细胞亚显微结构表征等研究领域在单分子水平上进行显微分析的重要帮手。