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实时活细胞成像技术在临床医学中的应用
771 人阅读发布时间：2023-01-06 17:23
先天性心脏病等心脏大血管疾病患者需要外科手术治疗。心脏外科手术需要在心脏停跳状态下进行，而在心脏停跳过程中，不可避免地会出现不同程度的心肌损伤。应用心脏停搏液不仅可以在手术过程中诱导心脏快速停跳、保持心脏停跳期间的心脏静止状态、缩短心脏停跳时间，更大限度减少心肌损伤、维护正常的心脏功能，其优劣还可以直接影响手术效果。目前，许多临床试验比较了不同的心脏停搏液和心脏保护方案，但鲜有文章对体外条件培养的细胞进行研究。
本研究采用新一代活细胞实时动态成像及功能分析系统CellCyte X， 对作为体外模型的大鼠心肌细胞进行长时间成像和分析，评估了St.ThomasⅡ型心脏停搏液（ST2C）的可能用途以及细胞效应，并且预估了心脏细胞的安全暴露时间，这个结果对心脏保护和心脏外科手术中选择合适的方案提供了十分有意义的参考价值。
实验方法
将大鼠心肌细胞H9C2与冷停搏液共孵育24小时。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖细胞核抗原表达（PCNA）在置于细胞培养箱中的活细胞成像平台CellCyte X上测定细胞的活力、汇合性、细胞大小、巯基水平。另外通过超微结构（TEM）研究和全断层3D成像，观察对细胞形态的影响。
实验结果
1.细胞活力、汇合性和体积
ST2C的效果通过对H9C2细胞生存能力、汇合性和体积的分析得到了验证。
CellCyte X成像研究表明，短时间的暴露不会影响细胞的生存和汇合（图1）。在2h时细胞的活力是对照未处理细胞的50%以上（图1a）。汇流分析表明4h为终止时间，此后汇流开始下降（图1b）。细胞体积分析表明暴露于心脏停搏液的细胞体积增加，肿胀，并在24小时内保持不变（图1c）。同时，我们观察到了初始细胞体积的差异，这可能与实验程序方案有关，实验组细胞在测量前暴露于停搏液ST2C 10-15分钟，短暂的预孵育时间可能会导致细胞肿胀并保持24小时，我们观察到正常的细胞体积在同一时间内保持不变。
图1.ST2C对H9C2细胞的影响
2.心脏停搏液对心肌细胞形态的影响
超微结构（TEM）将暴露于ST2C后的细胞可视化（图2）。用ST2C孵育1h后，与对照未处理细胞相比，心肌细胞线粒体有轻微病理变化（图2b）。2h时线粒体的嵴轻微肿胀，这似乎与细胞体积结果相符，但细胞核显示出正常的、未受影响的大小和形状。此外我们观察到内质网轻微肿胀（图2c）。与ST2C孵育24小时后，形成空泡和髓磷脂体，其中一些含有电子致密物质（图2d），与未暴露的对照细胞相比，内质网和线粒体显示出正常的形态。这些结果表明ST2C对H9C2细胞超微结构的影响具有时间依赖性。
图3展示了H9C2细胞的三维视图，可见无扰动形态。和TEM研究类似，只有更长的孵育时间才导致空泡化增加。接着，在24小时后测量巯基的水平，如图4所示，暴露的时间越长，对H9C2细胞越有害。观察到ST2C显著增加了SH组的水平，这可能与体积增加和细胞肿胀有关。然后通过免疫染色反应来可视化，表1和表2显示暴露于ST2C 24h后增殖标记物PCNA和Ki67表达增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后发生染色反应的细胞数量增加。在Ki67的情况下，我们可以在所有情况下几乎100%的细胞中检测到免疫染色反应，其中24h时免疫染色反应最强烈。
图2.H9C2细胞的透射电镜图 （a）未处理对照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心脏麻痹。C： 细胞质M：线粒体，N：细胞核，ER：内质网，GA高尔基体；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶体。
图3. H9C2细胞全息层析显微成像 （a)未经处理对照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI标记物染色的蓝色细胞核
图4.用ST2C孵育24小时后，大鼠成肌细胞中作为蛋白质损伤标志物的巯基（SH-）水平。数据以µM/L蛋白质表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.与ST2C孵育后H9C2细胞中PCNA表达的分析（*p<0.05）
表2.与ST2C孵育后H9C2细胞中Ki67表达的分析（*p<0.05）
实验结论
使用活细胞成像平台CellCyte X 对体外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心脏停搏液（ST2C）可以通过增加蛋白二硫化物和增殖标记物（PCNA和Ki67）来保护和维持H9C2大鼠心肌细胞，且不会对形态学造成显著的形态学变化。但是对于敏感的新生儿成肌细胞，保护时间限制在4小时内。本次实验结果表明，St.ThomasⅡ型心脏停搏液对保护心肌细胞有一定的作用，并且是一种经济且简单的解决方案。
CellCyte X 在临床医学领域中的成像优势
新一代活细胞实时动态成像及功能分析系统CellCyte X可以为临床医学提供自动化的、连续的动态细胞生长分析:
一、提高细胞活率：可以内置在任何厂牌的培养箱中，降低了实验过程中对细胞的干扰
二、实时收集与分析数据：在整个实验过程中，可实时对数据进行收集与处理
三、通量高：可同时放置6块微孔板，更大限度满足您对实验通量的需求
四、开放式设计：便于对细胞生长环境的维持，提高了实验环境的可控性与更佳的细胞状态
五、软件平台简洁直观：直观的成像与分析界面设计，方便使用者学习与操作，人人都可轻易上手
六、三通道荧光：增强的轮廓成像模式，除了明场还有红、蓝、绿3色荧光通道，让实验可进行多重复用
七、数据分析功能强大：每次实验可根据需求采集存储数千张五百万像素的高清图像
八、设计紧凑：仪器结构设计紧凑，易于安装与维护，大幅降低了维护成本
如果您想了解更多，欢迎联系我们。
本研究采用新一代活细胞实时动态成像及功能分析系统CellCyte X， 对作为体外模型的大鼠心肌细胞进行长时间成像和分析，评估了St.ThomasⅡ型心脏停搏液（ST2C）的可能用途以及细胞效应，并且预估了心脏细胞的安全暴露时间，这个结果对心脏保护和心脏外科手术中选择合适的方案提供了十分有意义的参考价值。
实验方法
将大鼠心肌细胞H9C2与冷停搏液共孵育24小时。孵育后，使用改良的 Ellman’s法、Ki67以及增殖细胞核抗原表达（PCNA）在置于细胞培养箱中的活细胞成像平台CellCyte X上测定细胞的活力、汇合性、细胞大小、巯基水平。另外通过超微结构（TEM）研究和全断层3D成像，观察对细胞形态的影响。
实验结果
1.细胞活力、汇合性和体积
ST2C的效果通过对H9C2细胞生存能力、汇合性和体积的分析得到了验证。
CellCyte X成像研究表明，短时间的暴露不会影响细胞的生存和汇合（图1）。在2h时细胞的活力是对照未处理细胞的50%以上（图1a）。汇流分析表明4h为终止时间，此后汇流开始下降（图1b）。细胞体积分析表明暴露于心脏停搏液的细胞体积增加，肿胀，并在24小时内保持不变（图1c）。同时，我们观察到了初始细胞体积的差异，这可能与实验程序方案有关，实验组细胞在测量前暴露于停搏液ST2C 10-15分钟，短暂的预孵育时间可能会导致细胞肿胀并保持24小时，我们观察到正常的细胞体积在同一时间内保持不变。
图1.ST2C对H9C2细胞的影响- MTT法测定存活率；（b）细胞汇合性；（c）暴露24h后的细胞体积；可行性结果表示为平均值±SD。单向方差分析：*p<0.05，**p>0.005。
2.心脏停搏液对心肌细胞形态的影响
超微结构（TEM）将暴露于ST2C后的细胞可视化（图2）。用ST2C孵育1h后，与对照未处理细胞相比，心肌细胞线粒体有轻微病理变化（图2b）。2h时线粒体的嵴轻微肿胀，这似乎与细胞体积结果相符，但细胞核显示出正常的、未受影响的大小和形状。此外我们观察到内质网轻微肿胀（图2c）。与ST2C孵育24小时后，形成空泡和髓磷脂体，其中一些含有电子致密物质（图2d），与未暴露的对照细胞相比，内质网和线粒体显示出正常的形态。这些结果表明ST2C对H9C2细胞超微结构的影响具有时间依赖性。
图3展示了H9C2细胞的三维视图，可见无扰动形态。和TEM研究类似，只有更长的孵育时间才导致空泡化增加。接着，在24小时后测量巯基的水平，如图4所示，暴露的时间越长，对H9C2细胞越有害。观察到ST2C显著增加了SH组的水平，这可能与体积增加和细胞肿胀有关。然后通过免疫染色反应来可视化，表1和表2显示暴露于ST2C 24h后增殖标记物PCNA和Ki67表达增加。
PCNA分析表明，暴露于ST2C暴露24h后发生染色反应的细胞数量增加。在Ki67的情况下，我们可以在所有情况下几乎100%的细胞中检测到免疫染色反应，其中24h时免疫染色反应最强烈。
图2.H9C2细胞的透射电镜图 （a）未处理对照；（b）1h后；（c） 2h和（d）24h使用基于ST2的心脏麻痹。C： 细胞质M：线粒体，N：细胞核，ER：内质网，GA高尔基体；MB髓鞘；V空泡；L-溶酶体。图3. H9C2细胞全息层析显微成像 （a)未经处理对照；（b）暴露于ST2C 1h后；和（c）暴露于ST2C 24h。DAPI标记物染色的蓝色细胞核图4.用ST2C孵育24小时后，大鼠成肌细胞中作为蛋白质损伤标志物的巯基（SH-）水平。数据以µM/L蛋白质表示，并以平均值±SD表示。*p<0.05。
表1.与ST2C孵育后H9C2细胞中PCNA表达的分析（*p<0.05）
表2.与ST2C孵育后H9C2细胞中Ki67表达的分析（*p<0.05）实验结论
使用活细胞成像平台CellCyte X 对体外模型研究表明，基于St.ThomasⅡ型心脏停搏液（ST2C）可以通过增加蛋白二硫化物和增殖标记物（PCNA和Ki67）来保护和维持H9C2大鼠心肌细胞，且不会对形态学造成显著的形态学变化。但是对于敏感的新生儿成肌细胞，保护时间限制在4小时内。本次实验结果表明，St.ThomasⅡ型心脏停搏液对保护心肌细胞有一定的作用，并且是一种经济且简单的解决方案。
CellCyte X 在临床医学领域中的成像优势
图5. CellCyte X仪器
新一代活细胞实时动态成像及功能分析系统CellCyte X可以为临床医学提供自动化的、连续的动态细胞生长分析:
一、提高细胞活率：可以内置在任何厂牌的培养箱中，降低了实验过程中对细胞的干扰
二、实时收集与分析数据：在整个实验过程中，可实时对数据进行收集与处理
三、通量高：可同时放置6块微孔板，更大限度满足您对实验通量的需求
四、开放式设计：便于对细胞生长环境的维持，提高了实验环境的可控性与更佳的细胞状态
五、软件平台简洁直观：直观的成像与分析界面设计，方便使用者学习与操作，人人都可轻易上手
六、三通道荧光：增强的轮廓成像模式，除了明场还有红、蓝、绿3色荧光通道，让实验可进行多重复用
七、数据分析功能强大：每次实验可根据需求采集存储数千张五百万像素的高清图像
八、设计紧凑：仪器结构设计紧凑，易于安装与维护，大幅降低了维护成本
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